Statt im Gefängnis seine Strafe für Beamtenbeleidigung anzutreten, vergnügt sich Gabriel von Eisenstein inkognito und feuchtfröhlich auf einem Ball des Prinzen Orlofsky. Doch am nächsten Morgen folgt die grosse Aus- beziehungsweise Ernüchterung: Der exotische Ballflirt entpuppt sich als eigene Ehefrau, und der neue Freund ist der Gefängnisdirektor. Blamiert muss Eisenstein erkennen, dass er Opfer einer Racheintrige seines Freundes Dr. Falke geworden ist.
Die Vorgeschichte, die den Titel der Operette erklärt: Von Eisenstein lässt seinen Freund Falke nach einer Ballnacht betrunken und als Fledermaus verkleidet am Morgen durch die Strassen irren. Das ist für den Notar, der von dem Zeitpunkt an Dr. Fledermaus genannt wird, eine peinliche Situation.